氯霉素快速检测人工抗原及多克隆抗体的研制
杨小姣，张建新，高志贤
（1西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西，杨凌，712100；
2军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050，）
摘要 分别采用活性酯法和重氮化法,将半抗原氯霉素与载体牛血清白蛋白(BSA) 和卵清白蛋白OVA）偶联,制得氯霉素胶体金免疫试纸条免疫原和包被原，经紫外光谱、红外光谱鉴定偶联结果并计算结合比，用所得免疫原免疫兔子。结果表明：紫外测定结果偶联物与半抗原、和载体蛋白的吸收曲线及最大吸收波长有明显区别且偶联物的摩尔消光系数显著大于半抗原和载体蛋白的摩尔消光系数；红外光谱分析结果也证实偶联成功。动物免疫四次后，经ELISA法检测抗血清效价为1：390625，可以满足快速免疫分析的需要，并进一步证实人工抗原合成成功。
关键词 氯霉素 人工抗原 多克隆抗体
Development Man-made Antigens and Polyclonal Antibody of chloramphenicol for rapid detection
Yang Xiaojiao1, Zhang Jianxin1,Gao Zhixian2
(1Northwest scien-tech university of agriculture & forestry，The college of food scince & engineering, Shaanxi Yangling 712100; 2Institute of Hygiene & Environmental Medicine , Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050)
Abstract : :In order to establish a immunochromatography assay for rapidly examing residual chloramphenicol (CAP)in food,it was necessary for synthesize the man-made antigens of chloramphenicol firstly.The actived ester reaction and diazotization reaction were employed respectively to synthesize the antigen of chloramphenicol,and identified with UV-scanning and Infrared spectrometry(IRS). The rabbits were immunized with the man-made antigens and the collected antiserum was evaluated by ELISA.The results demonsrated that the antigen of chloramphenicol was synthesized successfully. The ELISA revealed that the reactive titer of the prepared antibody against CAP-BSA was up to 1:340625.
Keywords: chloramphenicol man-made antigens polyclonal antibody
氯霉素是一种广谱抗生素，1947年从委内瑞拉链霉菌菌属中提取出来，1948年结构确定以后成为第一个可以人工合成的抗生素[1]。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用, 对立克次体、衣原体也有抑制作用。因其效高价廉, 曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床,并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。但随着科学的发展，氯霉素被证明对机体有很大的毒副作用[2]，如骨髓造血机能抑制毒性，遗传毒性，生殖毒性，神经毒性，灰婴综合症。此外长期微量摄入氯霉素, 不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性, 而且会引起机体正常菌群失调, 使人们易感染各种疾病。因此世界上许多国家禁止此药用于生产食品动物, 并规定了在畜产品中氯霉素不得检出。随着氯霉素事件的屡次发生，检测限问题已成为人们关注的焦点, 发达国家对检出限的要求越来越严格。欧盟由原来规定的10μg/kg降至0.1 μg/kg, 比原标准提高了100 倍。美国FDA规定的检出限也由原来5 μg/kg改为1 μg/kg, 即将降为0. 3 μg/kg[3]，且目前正在研究应用更灵敏的方法, 可使检出限达到0. 1 μg/kg。随着各国对氯霉素检测限要求的降低，目前检测CAP常用的方法: 微生物法、气相色谱法( GC) 、高效液相色谱法、比色法、免疫学分析方法检测方法，前四种方法存在耗时，成本高且仅限于实验室操作，不能满足现场检测及大量样本的快速筛选的需要，免疫学分析方法因其简便，快速，灵敏度高，经济的特点在氯霉素检测方法的研究已逐渐崭露头角。本文通过活性酯法[4-7]和重氮化法[8]合成氯霉素人工抗原，经紫外扫描和红外光谱鉴定[9]偶联成功，得到氯霉素的完全抗原，通过动物试验获得效价高达1:390625的多克隆抗体，为下一步氯霉素快速免疫分析方法的建立奠定坚实的基础。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
新西兰纯系白兔6只，购于北京军事医学科学院实验动物研究中心，为经检疫无病原菌的一级动物，体重为1.5 ~2.0kg，均为雄性。
1.1.2试剂
氯霉素标准品购自Amresco公司，琥珀氯霉素标准品购自Sigma(美国)，牛血清白蛋白(BSA) 购自Amresco公司，卵清白蛋白(OVA)购自Sigma公司，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)购自Sigma(美国)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)天津市试剂批发部经售，弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)购自Sigma(美国)，弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于天津华生生物技术有限公司。其余试剂为国产分析纯。
1.1.2仪器
88-1型定时恒温磁力搅拌器由上海司乐仪器有限公司生产，京立LGR10-4.2型冷冻离心机由北京医用离心机厂生产， ALPHA1-2冷冻干燥机由Martin Christ(德国)生产，Cary50紫外可见分光光度计由Varian生产(美国)，96 孔聚乙烯平底微滴板，高压灭菌锅，恒温培养箱，振荡器，酶标分析仪。透析袋和透析袋夹购自华生生物工程公司。
1.2方法
1.2.1氯霉素免疫原和包被原的合成
氯霉素化学名称为D-苏阿型-1-对硝基苯基-2-二氯乙酰胺基-1, 3—丙二醇, 简称氯胺丙醇, 分子式为C11H12O5 N2CL2, 分子量为323.13,化学结构式如图1 所示。因氯霉素是小分子物质，分子量较小（323.13），只具有反应原性不具备免疫原性，因而氯霉素作为一种半抗原首先要与大分子载体相连接，才能刺激机体
图1 氯霉素的结构式
B淋巴细胞产生相应抗体。由氯霉素的结构式可知，其分子结构中既不含氨基也没所有羧基不能直接与载体蛋白偶联，所以本研究从两个方面着手合成氯霉素全抗原，一是选取氯霉素的结构类似物琥珀氯霉素合成全抗原即活性酯法，二是直接对氯霉素的进行衍生化进而合成全抗原即重氮化法。
1.2.1.1活性酯法合成氯霉素免疫原和包被原
用活性酯法将含有羧基的半抗原琥珀氯霉素(Hap)与载体蛋白质(用Pro表示，本论文采用BSA或OVA)进行偶联。称取Hap 0.40mmol、NHS 0.40mmol、DCC 0.44mmol溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺，在22℃搅拌5小时后，离心，得“活性酯上清液” 。 将100mgPro溶解于10ml 0.05mol/l，pH 8的磷酸盐缓冲液（PB）中，在4℃条件下，将上面得到的“活性酯上清液”缓慢地滴加入Pro溶液中，同时剧烈搅拌。反应得到的混合物在4℃缓慢搅拌24h，以使偶联充分完成。反应后的溶液用0.01 mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）充分透析，每天换液2次。对透析外液进行紫外可见光吸收波长扫描，直到不再出现Hap特征吸收峰为止。将透析后的Hap-Pro偶联物溶液进行真空冷冻干燥，以Hap-BSA作为动物实验的免疫原，Hap-OVA作为胶体金免疫试纸条实验中的包被原。
1.2.1.2重氮化法合成氯霉素免疫原和包被原
用重氮化法将含有芳香氨基的半抗原（Hap）与载体蛋白质进行偶联。具体方法参照文献[8]。
1.2.2人工抗原(Hap-BSA和Hap-OVA) 的鉴定
1.2.2.1紫外可见光吸收波长扫描
将半抗原(Hap)、载体蛋白质(BSA和OVA)、半抗原-蛋白质偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA) 分别用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至合适浓度，在200-400nm波长处进行紫外可见光吸收波长扫描，观察三者紫外可见光吸收光谱的关系，计算半抗原与载体蛋白质的结合比。
1.2.2.2 红外光谱分析：将合成好的半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)、半抗原及载体蛋白做红外光谱检测。
1.2.3氯霉素多克隆抗体的制备与检测
在对新西兰大白兔饲养一周，观察无不适反应后从耳缘静脉取血，提取血清，以备抗体制备时进行阴性对照。取上述两种方法制备完成的人工抗原半抗原与牛血清白蛋白结合物用灭菌生理盐水配成1mg /mL，取出3ml 1mg /mL的与等体积弗氏完全佐剂混合，取一长约4厘米的塑料管将两支注射器连接，反复推拉对此混合物进行完全乳化。对家兔进行背部皮下多点免疫，初次免疫剂量为每只家兔1mL乳化液。4周后进行第二次免疫，免疫剂量同基础免疫，佐剂更换为弗氏不完全佐剂。以后每二周进行一次加强免疫，共进行四次，从第二次免疫开始，每次免疫一周后耳缘静脉取血，用间接ELISA法测定抗体效价。效价测定方法如下：用Hap-BSA包被酶联反应板，5μg/孔，37℃孵育1h，4℃过夜。将兔抗血清倍比稀释成1：5至1：1953125的九个稀释度，将免疫前提取的血清稀释成1：500和1：1000做阴性对照，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，显色剂用四甲基联苯胺，检测波长为450nm，测定光密度值。
2. 结果
2.1 半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)紫外可见光吸收波长扫描分析
偶联物溶液中偶联物的绝对含量通常以蛋白质的相对浓度来表示(即每mL偶联物溶液中含蛋白质多少mg) , 所以可通过测定偶联物溶液中蛋白质的相对含量(mg/mL )来测定偶联物浓度。采用紫外分光光度法测定交联比的原理是, 利用物质对光的吸收与其浓度呈比例的关系, 分别测定被偶联的两种分子的浓度。在大分子和小分子的偶联物中, 2种分子均有各自不同的最大紫外吸收峰, 且在相应的最大吸收峰波长处的吸光度值(A )与其浓度成比例; 但在偶联物的紫外扫描光谱中, 则表现为各自的光谱图呈叠加性质。该法操作简单且无样本损耗。
紫外扫描结果如图1至图4所示。从图1至图4及可以看出半抗原、载体蛋白和合成抗原的紫外吸收曲线明显不同，表征物质性质的两个参数最大吸收波长及摩尔消光系数也不同，根据朗伯-比尔定律计算出各物质的消光系数及结合比，结果如表1所示。从表1可知，合成抗原的消光系数显著大于半抗原及载体蛋白，这证明有发色团和助色团的引入。可初步证明偶联成功。
表1 各样品紫外扫描结果 Table1 UV-scanning results of samples
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扫描样本 Hap Hap BSA OVA Hap-BSA Hap-BSA Hap-OVA Hap-OVA
Samples (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅰ) (Ⅱ) |
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λmax(nm) 276 277.6 278.5 279.9 275.5 275 275 278.9 |
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∈ 10355 11083 45900 37575 164523 372722.64 49402 46601 |
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结合比 12 30 2 1 |
注：Hap（Ⅰ）为琥珀氯霉素 Hap（Ⅱ）为氯霉素；∈代表摩尔消光系数
图1 活性酯法免疫原（Hap-BSA）的紫外图谱
图3重氮化法免疫原包被原（Hap- BSA）的紫外图谱
图2活性酯化法包被原（Hap- OVA）的紫外图谱
图4重氮化法包被原（Hap-OVA）的紫外图谱
2.2半抗原-偶联物(Hap-BSA和Hap-OVA)红外结果分析
图5 琥珀氯霉素的红外图谱
图6琥珀氯霉素-BSA的红外图谱
图7 BSA的红外图谱
图8 琥珀氯霉素-OVA的红外图谱
从图5可以看出，在琥珀氯霉素的红外图谱中于3000cm-1附近有四个弱吸收峰（3077.7，2960.2，2921.9，2852.4 cm-1），这是苯环的伸缩振动；1500~1600 cm-1处有两个峰，是苯环的骨架振动； 1350 cm-1处有一峰，为-NO2的伸缩振动；指纹区812.4，854.5 cm-1处有两个峰，说明为对位硝基取代苯。在1850~1600 cm-1处有两个峰，说明有C=O存在，接着从指纹区的1300~1000 cm-1处发现有酯的伸缩振动强吸收，3500~3300 cm-1 处有-NH的伸缩运动，从而进一步肯定有酯基（1730.1 cm-1）、酰胺基（1682.4 cm-1）存在。
同理，可以判断图6，图8中除具有和载体蛋白相似的吸收峰外，均有对位硝基取代苯存在（1524.9，853.3 cm-1），从而断定是半抗原结合到载体蛋白上的结果。红外图谱进一步证实抗原偶联成功。
2.3氯霉素多克隆抗体的检测结果：在第一次免疫后的第五、七、九周试血，用间接ELISA法测定抗体效价，重氮化法和活性酯法制备的免疫原刺激机体产生的抗体效价结果分别如图9和图10所示。第四次免疫后试血效价保持在1：390625，因效价不再上升，试血完毕后2天对大白兔心脏采血处死，提取血清冻干分装保存。
图9抗体效价上升图 图10抗体效价上升图
3 讨论
本实验采用两种方法合成氯霉素免疫原和包被原，经紫外扫描同时测定蛋白含量，根据朗伯-比尔定律计算摩尔消光系数及结合比。其中重氮化法是在低温条件，氯霉素上苯环上的对位-NO2被还原成-NH2然后氨基与亚硝酸反应生成重氮盐，再与载体蛋白分子上的酪氨酸、组氨酸、色氨酸残基反应形成偶氮键交联的结合物，从而制备出氯霉素的免疫原和包被原。这是目前应用较普遍的一种合成氯霉素人工抗原的方法，但重氮化法的偶联产物为淡黄色，不适合做包被原，可用作免疫原。本文所采用的另一种方法，活性酯法是直接应用半抗原结构类似物琥珀氯霉素进行活化后与载体蛋白偶联，操作简单，试剂定量关系明确，副产物少，偶联物结合比较高，冻干粉为白色，即适合做免疫原又适合做包被原。
试验结果表明，以BSA做载体蛋白用两种不同的方法与半抗原偶联结合比均较高，而用OVA做载体蛋白时结合比很低，可能是由于OVA的溶解性较差，性质不稳定，易变性，且OVA所含有的可与载体蛋白缩合的活性基团如-NH2、-COOH、酚基、咪唑基等均比BSA少约1倍，不易与半抗原结合所致。可以选用价格稍高，但溶解性，稳定性好的血蓝蛋白（KLH）代替OVA做载体蛋白。
仪器鉴定只能证明偶联成功，实际免疫原性尚需动物免疫试验证明。用本试验所合成的免疫原（Hap-BSA）的动物免疫试验。据报道，制备氯霉素多克隆抗体从基础免疫至最终提取抗血清，时间持续130多天，我们考虑到制备时间过长，在参考相关文献[10]的基础上，采用缩短免疫周期的方案进行抗体制备，每次加强免疫一周后监测抗体效价，结果在60多天的时间内也获得了较高效价的抗血清。最终结果表明，本试验制备人工抗原和多克隆抗体的方法与国外的制备方法相比，在缩短一半时间的情况下，同样能获得较高效价的抗体。
参考文献
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杨小姣（1983-），女，硕士，研究方向：食品营养与卫生学。
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